基因治療是通過將修飾的基因傳遞至靶細(xì)胞中，從而把患者體內(nèi)的突變基因替換為相對應(yīng)的健康基因拷貝來實(shí)現(xiàn)治療或者預(yù)防疾病的目的。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，基因治療是從根本上對疾病進(jìn)行控制，所以有著非常好的發(fā)展前景，在世界范圍內(nèi)得到越來越多醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注和投入。

將正?；颍ㄍ庠矗?dǎo)入生物細(xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體，基因轉(zhuǎn)移的方法分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法。

病毒越來越多的用作載體，用于傳遞基因治療的遺傳物質(zhì)和疫苗應(yīng)用。重組腺相關(guān)病毒（recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV）是基因治療最為常用的病毒載體之一。

一、如何開發(fā)高效安全的 rAAV 療法?

為了開發(fā)通過受控和經(jīng)濟(jì)的制造工藝生產(chǎn)的高效的 rAAV 療法，需要解決從病毒衣殼設(shè)計(jì)到確定最佳工藝和配方條件，再到全面質(zhì)量控制的多重挑戰(zhàn)。應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，需要針對 rAAV 樣品下列屬性進(jìn)行量身定制的分析表征：

?  測定衣殼蛋白或者顆粒滴度（capsidor particle titer）

?  完整 rAAV 顆粒的百分比

?  空-載比（Full-empty ratio）

?  顆粒的粒徑

?  聚集體形成（aggregate formation）

?  熱穩(wěn)定性（Thermal stability）

?  基因組釋放（genome release）

?  衣殼電荷（capsid charge）等

而所有這些都可能影響最終產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。

通常，rAAV 滴度和病毒載量是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）、液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ddPCR）、分析超速離心（AUC）和電子顯微鏡（EM）的技術(shù)組合測定的。這些方法通常既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且其準(zhǔn)確性和精確性也值得懷疑[1]。因此，業(yè)內(nèi)越來越需求一種不依賴于使用專用試劑和昂貴的參考標(biāo)準(zhǔn)品的快速分析解決方案。

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、尺寸排阻色譜-多角度光散射（SEC-MALS）、納米顆粒跟蹤技術(shù)（NTA）、等溫滴定量熱法（ITC）和差式掃描量熱法（DSC）可以提供有關(guān)病毒載體的關(guān)鍵分析和質(zhì)量屬性的重要信息，從而能夠?qū)Χ喾N參數(shù)進(jìn)行表征、比較和優(yōu)化。

表1 總結(jié)了病毒載體研究中各種重要的關(guān)鍵屬性（CQA），以及馬爾文帕納科可以對應(yīng)提供表征此類信息的各項(xiàng)技術(shù)。

DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC屬于無標(biāo)記的生物物理技術(shù)，需要最少程度的方法開發(fā)，并且可以很容易的應(yīng)用于各個(gè)階段，強(qiáng)化了基因治療開發(fā)的分析工作流程。

二、高效的表征技術(shù)概念解讀

動(dòng)態(tài)光散射（DLS）

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是一種非侵入式技術(shù)，可以測量由顆粒分散體系或分子溶液引起的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間的波動(dòng)。由于進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的顆?；蛘叻肿拥碾S機(jī)運(yùn)動(dòng)，散射光的強(qiáng)度會(huì)隨之發(fā)生波動(dòng)。使用自相關(guān)算法分析這些強(qiáng)度波動(dòng)可以確定平移擴(kuò)散系數(shù)，隨后根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程確定流體力學(xué)尺寸。

多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）

多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）通過使用三個(gè)不同的檢測角度（背面、側(cè)面和正面）并將獲取的光散射信息組合成一個(gè)與角度無關(guān)（Angular-Independent）的粒徑分布，從而可以對多模態(tài)的樣品進(jìn)行更高分辨率的尺寸測定。應(yīng)用MADLS技術(shù)的擴(kuò)展還可以測量出顆粒濃度（Concentration）。

電泳光散射（ELS）

電泳光散射（ELS）測定來自在電場中進(jìn)行電泳的顆粒或者分子的散射光的頻移（Frequency Shift），并能夠計(jì)算出Zeta電位。顆粒的Zeta電位是顆粒在特定介質(zhì)中獲得的總電荷，可用于預(yù)測分散體系的穩(wěn)定性并深入了解所研究的顆粒的表面化學(xué)。

尺寸排阻色譜（SEC）

尺寸排阻色譜（SEC）是一種分離技術(shù)，可根據(jù)分子進(jìn)出柱中多孔凝膠基質(zhì)的流體力學(xué)半徑來分離分子。搭配一系列先進(jìn)的檢測器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以測量絕對分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他參數(shù)。

差式掃描量熱法（DSC）

差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質(zhì)或其他生物分子熱穩(wěn)定性的技術(shù)，無需外在熒光素或者內(nèi)源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發(fā)生熱變性過程中的熱容變化來實(shí)現(xiàn)。

案例研究 | 綜合使用多種技術(shù)表征 rAAV性狀：衣殼分子量、聚集狀態(tài)、滴度、穩(wěn)定性……

1，空 rAAV5 衣殼分析

SEC-MALS (OMNI-SEC)測量產(chǎn)生的關(guān)鍵數(shù)據(jù)是絕對分子量，與柱保留時(shí)間或用于校準(zhǔn)系統(tǒng)的任何標(biāo)準(zhǔn)無關(guān)。在空rAAV的情況下（Fig.1 和表2），主要單體的Mw為3.84 x 10⁶ g/mol。空衣殼蛋白的理論分子量為3.8 x 10⁶ g/mol，證實(shí)該分析結(jié)果符合預(yù)期。

圖1 rAAV5 空殼三重色譜圖

表2 rAAV5空殼的定量參數(shù)

Mw/Mn 描述樣品的分散性，接近1的值表示峰中有單個(gè)群體，遠(yuǎn)高于1的值表示峰內(nèi)有多個(gè)群體。在空 rAAV 的情況下，單體和二聚體的 Mw/Mn 值接近1，表明是單一群體。聚集體和碎片 Mw/Mn 值顯著高于1，表明單個(gè)峰內(nèi)具有不同分子量的多個(gè)群體（表2）。

樣品的分?jǐn)?shù)（Fraction of Sample）描述了樣本在群體之間的分布情況，在這種情況下，84.7% 的樣品是單體。蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)（Fraction of Protein）表示樣品中衣殼的百分比；在這種情況下，單體是99.8%的衣殼。這證實(shí)樣品是空的 rAAV5 。從這種單一分析方法中獲得的另一個(gè)關(guān)鍵信息是樣品滴度；在這種情況下，對于空的 rAAV5，測得的滴度為 5.91x10¹³ vp/mL。

2，完整 rAAV5 衣殼分析

完整 rAAV5衣殼的SEC-MALS (OMNISEC) 分析如圖2和表3所示。對于主要的單體峰，計(jì)算出的符合Mw為4.49 x 10⁶ g/mol，其中86%為衣殼。這樣，完整的rAAV5的蛋白質(zhì)組分的Mw為3.86 x 10⁶ g/mol，與表2中的空rAAV5衣殼生成的數(shù)據(jù)一致。單體部分占比93%，樣品具有總滴度7.48 x 10¹³ vp/mL。

圖2 完整 rAAV5 的三重色譜圖

表3 完整 rAAV5 的定量參數(shù)

3，rAAV5 穩(wěn)定性研究

病毒衣殼的穩(wěn)定性和功能是一種平衡行為。病毒衣殼必須足夠穩(wěn)定以包含和保護(hù)其中的基因組，與宿主細(xì)胞表面結(jié)合，它們必須提供足夠的構(gòu)象穩(wěn)定性以在復(fù)制位點(diǎn)釋放基因貨物。

AAV載體脫殼的機(jī)制仍然知之甚少。衣殼脫殼和基因組釋放似乎需要結(jié)構(gòu)變化。基于差示掃描熒光法和差示掃描量熱法（DSC）收集的AAV熱穩(wěn)定性已發(fā)表數(shù)據(jù)，AAV熱轉(zhuǎn)變的Tm值與衣殼解聚過程有關(guān)，可作為AAV血清型的鑒定指標(biāo)；一種血清型的空AAV衣殼和完整AAV衣殼的Tm值通常非常相似，并且它們與衣殼動(dòng)力學(xué)、衣殼脫殼和基因組釋放沒有明顯的相關(guān)性。

圖3 空rAAV5 和完整 rAAV5的DSC數(shù)據(jù)比較，扣除空白和基線的DSC數(shù)據(jù)。垂直方向標(biāo)記的區(qū)域具有明顯不同的熱轉(zhuǎn)變過程。

表4 從DSC獲得的空 rAAV5 和完整 rAAV5 樣品的熱穩(wěn)定性結(jié)果

文章中記錄的完整和空 rAAV5 樣品的DSC曲線疊加（圖3），根據(jù)空 rAAV5 和完整rAAV5 樣品的整體 DSC 圖譜差異以及熱穩(wěn)定性參數(shù)（如 Tonset 和 Tm2，表 4），可以在圖 3 中 DSC 曲線上識(shí)別出四個(gè)不同的區(qū)域，它們可以暫且歸因于以下幾點(diǎn)：

#1■  僅在完整的 rAAV5 中出現(xiàn)的區(qū)域，從50℃一直延展至 75℃，這個(gè)過程大約 30 分鐘。這可能歸因于熱應(yīng)激下衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性變化導(dǎo)致的 ssDNA 的動(dòng)力學(xué)控制下的注射；

#2■在空 rAAV5 中出現(xiàn)的明顯的預(yù)轉(zhuǎn)變過程；

#3■  主要轉(zhuǎn)變過程，即協(xié)同的 rAAV5 衣殼蛋白發(fā)生解組裝，這由具有血清型特異性的 Tm 值所決定；

#4■  僅在完整 rAAV5 中出現(xiàn)的另外的轉(zhuǎn)變過程，很可能歸因于 ssDNA 的解鏈。

結(jié)論：以上幾例是綜合應(yīng)用馬爾文帕納科多種互補(bǔ)技術(shù)對基因治療常用的AAV載體一些關(guān)鍵屬性的表征，這些無標(biāo)記生物物理技術(shù)需要最少的方法開發(fā)，可以從衣殼設(shè)計(jì)階段到開發(fā)、配方開發(fā)和藥物原料和產(chǎn)品進(jìn)行深入表征，加強(qiáng)體內(nèi)基因治療開發(fā)的分析工作流程。

詳細(xì)內(nèi)容可參文獻(xiàn) (Pharmaceutics 2021, 13(4), 586; doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586）

[1] Burnham, B.; Nass, S.; Kong, E.; Mattingly, M.; Woodcock, D.; Song, A.; Wadsworth, S.; Cheng, S.H.; Scaria, A.; O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228–242

三、納米粒度及電位分析儀：DLS/ ELS/ MADLS
馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra 納米粒度及Zeta電位分析儀具有真正的多角度動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（MADLS®），提供更高的粒度測量分辨率，及與角度無關(guān)的粒度結(jié)果，并能夠測量顆粒濃度。

圖4 Zetasizer Ultra納米粒度及Zeta電位分析儀

四、OMNISEC 凝膠滲透色譜儀：GPC/SEC

馬爾文帕納科OMNISEC凝膠滲透色譜儀是一套完整的凝膠滲透/尺寸排阻色譜(GPC)/(SEC)，有前端色譜分離系統(tǒng)、檢測器和軟件組成，是靈敏準(zhǔn)確的多檢測器GPC/SEC 系統(tǒng)，可以準(zhǔn)確測定：

?  絕對分子量和分子量分布

?  特性粘度和分子結(jié)構(gòu)

?  樣品濃度

?  以及其他多種關(guān)鍵參數(shù)

圖5 OMNISEC凝膠滲透色譜儀

五、PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀：DSC
馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認(rèn)維持高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的最佳條件，提供簡潔、無縫的工作流程和自動(dòng)化批量數(shù)據(jù)分析，其所提供的熱穩(wěn)定性信息被業(yè)內(nèi)視為“金標(biāo)準(zhǔn)"技術(shù)，是一種非標(biāo)記、全局性的數(shù)據(jù)。

圖6 MicroCal PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀

關(guān)于馬爾文帕納科

馬爾文帕納科的使命是通過對材料進(jìn)行化學(xué)、物性和結(jié)構(gòu)分析，打造出客戶導(dǎo)向型創(chuàng)新解決方案和服務(wù)，從而提高效率和產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。通過利用包括人工智能在內(nèi)的技術(shù)發(fā)展，我們能夠逐步實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。這將讓各個(gè)行業(yè)和組織的科學(xué)家和工程師可解決一系列難題，如提高生產(chǎn)率、開發(fā)更高質(zhì)量的產(chǎn)品，并縮短產(chǎn)品上市時(shí)間。