差示掃描熒光法 （DSF，內(nèi)在熒光法）是一種經(jīng)濟(jì)高效且易于使用的非標(biāo)記生物物理技術(shù)，其原理是通過(guò)測(cè)量溫度升高時(shí)熒光發(fā)射的相應(yīng)變化來(lái)確定蛋白質(zhì)的熱變性轉(zhuǎn)變溫度（所謂的熔解溫度，T_m值）。

新一代高通量差示掃描熒光儀 SUPR-DSF 利用內(nèi)在熒光 (IF)技術(shù)，依賴(lài)于色氨酸固有熒光發(fā)射光譜波長(zhǎng)的變化。SUPR-DSF 使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的 384 微孔板，在幾小時(shí)內(nèi)，而不是幾天和幾周，就可以對(duì)數(shù)千個(gè)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)量和比較。SUPR-DSF 結(jié)合了低樣品用量和高通量兩個(gè)優(yōu)勢(shì)，解決了傳統(tǒng)技術(shù)所遇到的挑戰(zhàn)。

圖2內(nèi)在熒光 DSF 原理：依賴(lài)于色氨酸固有熒光發(fā)射光譜的變化

在生物藥物早期發(fā)現(xiàn)中可以使用 SUPR-DSF 進(jìn)行突變體的比較和篩選，本例對(duì) 16 個(gè)樣品進(jìn)行比較，其中包括 1 個(gè)野生型蛋白（WT）和 15 個(gè)單點(diǎn)突變體。

準(zhǔn)備終濃度為 0.2 mg/mL的樣品，以每孔 20 μL 的體積將其加入384微孔板，每個(gè)樣品做三次重復(fù)，在微孔板上放置透光膜以防止蒸發(fā)。微孔板以 1°C/min 的速率進(jìn)行掃描，掃描溫度范圍為 20°C - 100°C。使用標(biāo)準(zhǔn)方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，然后通過(guò)熔解溫度 T_m 對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行排序。

SUPR-DSF 生成了16個(gè)樣品的高質(zhì)量熔解曲線(xiàn)，并且，計(jì)算出的三次重復(fù)數(shù)據(jù)的熔解溫度差異小于 0.2°C。如圖3所示，與野生型WT（藍(lán)色）相比，其中3個(gè)突變體（9、13和14）的熔解曲線(xiàn)左移，說(shuō)明其蛋白穩(wěn)定性降低；其余12個(gè)突變體的穩(wěn)定性均有所提高，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提高最大。

圖3 15個(gè)突變體（橙色）與野生型（藍(lán)色）的熔解曲線(xiàn)對(duì)比

圖4展示了幾個(gè)代表性樣品的熔解曲線(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)發(fā)生了單一熱轉(zhuǎn)變（WT蛋白與突變體7和8），而另一些蛋白質(zhì)（突變體1和14）則清楚地顯示出兩次熱轉(zhuǎn)變，熔解曲線(xiàn)上有兩個(gè)拐點(diǎn)。此外，包括突變體1在內(nèi)的幾個(gè)突變體在第一次熱轉(zhuǎn)變時(shí)具有與突變體8非常相似的熔解曲線(xiàn)，但隨后在更高的溫度下進(jìn)行了第二次熱轉(zhuǎn)變。

突變蛋白質(zhì)從單一熱轉(zhuǎn)變到兩次熱轉(zhuǎn)變的變性能力表明，進(jìn)一步的修飾應(yīng)該關(guān)注于蛋白質(zhì)中較不穩(wěn)定的區(qū)域。通過(guò) SUPR-DSF 提供的數(shù)據(jù)，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進(jìn)行深入研究。

圖4 代表性樣品的熔解曲線(xiàn)

上述實(shí)驗(yàn)中SUPR-DSF在1.5小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了48個(gè)樣品（16個(gè)突變體，3次重復(fù)）的高質(zhì)量熔解曲線(xiàn)，但很容易擴(kuò)展到384個(gè)樣品（一塊384孔板），在同樣的掃描條件下完成384個(gè)樣品的測(cè)試也僅需1.5小時(shí)。

結(jié)論 Conclusion

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以看出SUPR-DSF與目前穩(wěn)定性研究的其他技術(shù)相比，具有非常顯著的高通量?jī)?yōu)勢(shì)。SUPR-DSF不僅記錄了熔解溫度 T_m，還可以給出：去折疊的起始溫度 T_onset和范特霍夫焓變?chǔ)_vH，從而更深入地了解樣品之間的差異。

綜上所述，新一代 SUPR-DSF具有高靈敏度、高通量和耗材通用性好等優(yōu)勢(shì)，使用10-20 μL樣品在90分鐘內(nèi)即可給出384個(gè)樣品的T_m、T_onset和ΔH_vH等信息，確定不同樣品之間的微小差異，避免候選藥物的下游失敗，從而大大節(jié)省了生物治療藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的時(shí)間和成本。